Substâncias químicas utilizadas no tratamento endodôntico podem afetar a qualidade da adesão na restauração final. O momento da hibridização dentinária (HD) pode atuar minimizando os efeitos dessas substâncias na dentina e influenciar na qualidade de adesão. Este estudo avaliou o momento da realização da HD e de diferentes substâncias químicas na resistência de união à dentina em dentes humanos. Vinte molares humanos foram distribuídos em quatro grupos experimentais: G1. RD – restauração direta em resina composta, sendo o grupo controle sem exposição às substâncias químicas ou restauração provisória; G2. HDT – hibridização dentinária tardia com HD no momento da restauração final, após exposição às substâncias químicas e restauração provisória; G3. HDI – hibridização dentinária imediata com HD após a simulação do tratamento endodôntico e previamente à restauração provisória; G4. HDP – hibridização dentinária prévia com HD previamente à exposição às substâncias químicas e restauração provisória. A dentina coronária foi exposta, submersa com hipoclorito de sódio 2,5%, EDTA 17% e cimento endodôntico, moldada com silicone de adição, restaurada provisoriamente, e estocada por 2 semanas em saliva artificial. Em seguida foi restaurada com resina composta e o teste de microtração foi realizado após 24 horas. Os palitos foram cortados no tamanho de 1mm2 e submetidos ao microtracionamento a 0,05mm/min (MPa) na máquina de ensaio universal. Após avaliação de normalidade e homogeneidade, os valores de resistência de união à microtração foram analisados por meio de ANOVA, teste de significância de 5%, seguidos por teste post hoc (Tukey). O maior valor de resistência de união foi encontrado no grupo controle (42,39 MPa ±5,69), logo em seguida o grupo HDP (41,51 MPa ±3,68), o grupo HDI (21,16 MPa ±9,66) e o menor valor no grupo HDT (9,86 MPa ±1,30). O grupo controle (RD) não apresentou diferença estatisticamente significante em relação a abordagem de hibridização dentinária prévia (HDP). Os grupos HDI e HDT apresentaram uma diminuição do valor de resistência a tração quando comparados ao grupo controle de 76,7% e 50,1%, respectivamente. Pode-se concluir que a hibridização dentinária previamente à exposição a substâncias químicas utilizadas no tratamento endodôntico influenciou positivamente a resistência de união à microtração das amostras estudadas.