Objetivo: avaliar o efeito antibacteriano de antissépticos bucais sobre S. mutans, E. faecalis e P. aeruginosa, por meio de testes de difusão em ágar e teste por exposição direta.Metodologia:Cepas de S. mutans (ATCC 25175), E. faecalis (ATCC 29212)e P. aeruginosa (ATCC 27853) foram inoculadas em 7 mL de BHI e incubadas a 37°C por 24 horas. Para o teste de difusão em ágar, 13 placas de Petri com 20 mL de BHIA foram inoculadas com 0,1 mL das suspensões microbianas, com auxílio de swabesterilizados, de modo a se obter um crescimento confluente. Trinta e seis discos de papel com 9 mm de diâmetro foram imersos nas soluções experimentais de cloreto de cetilpiridínio 0,07%, cloreto de cetilpiridínio 0,075%, gluconato de clorexidina 0,12% e cloreto de benzalcônio 0,13% mg durante um minuto. A seguir, três discos de papel contendo uma das soluções antissépticas foram colocados sobre a superfície do BHIA. As placas foram mantidas por uma hora em temperatura ambiente e incubadas a 37°C por 48 horas. Os diâmetros dos halos de inibição microbiana foram medidos valendo-se de duas medidas de forma perpendicular entre si, sendo obtida a média de seus comprimentos. Para o teste de exposição direta, 576 cones de papel absorventes esterilizados n°50 foram imersos na suspensão de micro-organismos por 5 minutos, e a seguir foram colocados em placas de Petri e cobertos com 10 mL de uma das soluções testes. Em intervalos de 1,5, 10 e 30 minutos, 3 cones de papel absorventes foram retirados do contato com as substâncias, transportados individualmente e imersos em 7 mL de Letheen Broth, e incubados a 37°C por 48 horas. O crescimento microbiano foi avaliado pela turbidade do meio de cultura. Um inóculo de 0,1 mL obtido do Letheen Broth foi transferido para 7 mL de BHI, e incubado nas mesmas condições descritas. O crescimento microbiano foi novamente avaliado pela turbidade do meio de cultura.Resultados: Os halos de inibição foram maiores que 10 mm para todas as substâncias e em todos os micro-organismos. A solução de cloreto de benzalcônio apresentou efeito antibacteriano contra os indicadores biológicos após 5 minutos em teste por exposição direta, enquanto que o cloreto de cetilpiridínio e o gluconato de clorexidina apresentaram efeito antibacteriano somente após 10 minutos. Conclusão: As soluções antissépticas estudadas apresentaram efeito antibacteriano por contato direto frente S. mutans, E. faecalis e P. aeruginosa.