Introdução: A espessura do substrato dentário constitui-se um fator que interfere no resultado da avaliação do nível de saturação de oxigênio da polpa, capaz de reduzir a acurácia do oxímetro de pulso. Este estudo avaliou a interferência da espessura de esmalte-dentina na interpretação do oxímetro de pulso, tendo como fatores de variação a saturação de oxigênio do dedo e a presença e ausência de luz. Materiais e Métodos: Quarenta e dois molares inferiores humanos hígidos foram seccionados na porção central no sentido mesiodistal. Após o seccionamento, as faces vestibular e lingual foram desgastadas na superfície correspondente à dentina e avaliadas nas espessuras de 4,0mm, 3,0mm e 2,0mm. Foi confeccionado um dispositivo de referência para o alinhamento do diodo emissor do oxímetro de pulso, face vestibular do dente, dedo mínimo do participante, face lingual e diodo receptor. O controle positivo do experimento foi realizado no dedo do participante sem a interposição das faces dentárias, e o negativo, por meio da justaposição das faces dentárias, sem o dedo do participante. Todas as mensurações foram efetuadas na presença e ausência de luz. As variáveis foram descritas pela média e desvio-padrão, e o intervalo de confiança apresentado. Para comparar os grupos foi empregada a análise de variância (ANOVA), seguida da Correção de Bonferroni. O teste t de Student foi usado para comparar amostras emparelhadas, e para avaliar a correlação entre o nível de saturação de oxigênio e do pulso foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Pearson. Considerou-se o nível de significância de 5%. Resultados: O nível médio de saturação de oxigênio no dedo mostrou-se mais baixo quando foi interposta a estrutura dentária de 4,00,2mm, 92,7% e 89,3%, na presença e ausência de luz, respectivamente, do que quando foi a de 3,00,2mm, 95,5% e 94,5%, e a de 2,00,2mm, 96,4% e 96,0% (P<0,001). O nível médio de saturação de oxigênio no controle positivo foi de 96,1%. Nas amostras do controle negativo não foi registrado resultado de oximetria e de pulso. Conclusões: A espessura da estrutura dentária interferiu na interpretação do oxímetro de pulso, com redução significativa do nível de saturação de oxigênio para espessuras maiores, e a presença e ausência de luz alteraram a interpretação do oxímetro de pulso.